徠卡激光共聚焦顯微鏡(如Leica SP8、Stellaris系列)是一種高分辨率三維成像系統(tǒng)，廣泛應用于生物醫(yī)學、材料科學等領域。其操作需結(jié)合光學、激光控制和圖像處理技術，以下是詳細操作指南：
一、操作前準備
1. 環(huán)境與設備檢查
環(huán)境要求：
獨立暗室或遮光環(huán)境，避免外界光線干擾熒光信號。
溫度控制在20-25℃，濕度≤60%，防止鏡頭結(jié)露或電路故障。
設備檢查：
確認激光器(如405nm、488nm、561nm、633nm)狀態(tài)指示燈正常(綠色為就緒)。
檢查物鏡(如10x/0.3、20x/0.75、63x/1.4油鏡)是否清潔，載物臺移動是否順暢。
開啟冷卻系統(tǒng)(如激光器水冷機)，確保溫度穩(wěn)定在設定值(通常18-22℃)。
2. 樣品準備
生物樣品：
活細胞需培養(yǎng)在共聚焦專用培養(yǎng)皿(如Lab-Tek II)中，避免使用普通玻片導致聚焦困難。
固定組織切片需用抗熒光淬滅封片劑(如ProLong Gold)封片，厚度≤20μm。
材料樣品：
非透明樣品需拋光至表面粗糙度Ra<0.1μm，透明樣品(如聚合物)需避免自發(fā)熒光干擾。
標記要求：
熒光染料需與激光波長匹配(如DAPI用405nm激發(fā)，Alexa Fluor 488用488nm激發(fā))。
多色標記時，確保染料發(fā)射光譜無重疊(可通過光譜拆分功能分離信號)。
二、基礎操作流程
1. 開機與初始化
啟動順序：
打開總電源 → 2. 啟動激光器冷卻系統(tǒng) → 3. 開啟顯微鏡主機 → 4. 啟動控制軟件(如LAS X或Stellaris Suite)。
軟件自檢：
軟件自動檢測激光器、掃描頭、載物臺等模塊，確認狀態(tài)為“Ready”。
運行“Daily Check”功能，校準光路和檢測系統(tǒng)靈敏度(如PMT增益、激光功率)。
2. 樣品定位與對焦
低倍鏡預覽：
選擇10x空氣鏡，關閉激光，使用透射光(如鹵素燈)快速定位樣品區(qū)域。
通過載物臺XY旋鈕或軟件導航功能移動至目標位置。
共聚焦對焦：
開啟488nm激光(低功率，如5%)，選擇“Live”模式實時觀察。
調(diào)節(jié)Z軸步進電機，使用“Fine Focus”工具逐步聚焦，直至熒光信號強。
切換至高倍物鏡(如63x油鏡)時，需在物鏡與蓋玻片間滴加專用浸油(如Type F油)。
3. 圖像采集參數(shù)設置
激光功率與PMT增益：
激光功率：從1%開始逐步增加，避免光漂白(通常不超過20%)。
PMT增益：調(diào)整至信號強度在100-800(12bit圖像)之間，避免飽和(>4095)。
掃描參數(shù)：
分辨率：根據(jù)需求選擇512×512(快速預覽)或2048×2048(高精度成像)。
掃描速度：線平均次數(shù)1-4次(噪聲大時增加)，幀平均次數(shù)1-8次(活細胞動態(tài)成像時減少)。
針孔大?。和ǔＴO為1 Airy單位(AU)，平衡分辨率與信噪比。
光譜設置：
多色標記時，在“Lambda Scan”模式下掃描樣品發(fā)射光譜，設置波長范圍(如DAPI: 410-480nm, Alexa Fluor 488: 500-550nm)。
4. 三維成像與時間序列
Z軸堆疊：
設置起始/結(jié)束位置和步長(如0.5μm)，軟件自動拍攝多層圖像并合成3D模型。
時間序列：
活細胞成像時，設置時間間隔(如每30秒1幀)和總幀數(shù)(如100幀)，記錄動態(tài)過程。
啟用“Autofocus”功能保持焦點穩(wěn)定，避免細胞移動導致離焦。
三、徠卡激光共聚焦顯微鏡功能應用
1. 光片照明模式(Light Sheet)
適用于厚樣品(如斑馬魚胚胎)的快速低光毒性成像。
操作步驟：
切換至光片模塊，調(diào)整照明光片厚度(通常2-5μm)。
設置雙攝像頭同步采集(如透射光與熒光信號)。
通過“Multi-View”功能拼接多角度圖像，重建三維結(jié)構(gòu)。
2. 超分辨率成像(如STED)
突破衍射極限，分辨率達20-50nm。
操作要點：
使用專用STED物鏡(如100x/1.4油鏡)和 depletion激光(如592nm)。
調(diào)整depletion激光功率(通常50-200mW)和相位掩模模式(如2D或3D STED)。
采集后使用“Huygens”或“Thunder”軟件進行反卷積處理。
3. 光譜拆分與線性去卷積
多色標記時分離重疊信號：
在“Lambda Scan”模式下獲取樣品發(fā)射光譜庫。
在“Spectral Unmixing”工具中加載光譜數(shù)據(jù)，軟件自動計算各通道純信號。
調(diào)整閾值去除背景噪聲，保存拆分后的圖像。
四、維護與保養(yǎng)
1. 日常清潔
光學元件：
用吹氣球清除物鏡、濾光片表面灰塵，禁用棉簽或紙巾直接擦拭。
若需清潔，用鏡頭紙蘸取少量乙醇(或?qū)Ｓ们鍧嵰?，以螺旋方式輕擦。
載物臺與樣品倉：
用防靜電布擦拭，避免殘留浸油或封片劑。
2. 激光器維護
使用限制：
連續(xù)工作不超過8小時，避免激光管過熱損壞。
關機時先降低激光功率至1%，再關閉激光器開關。
壽命監(jiān)測：
在軟件“Laser Status”界面查看剩余壽命(如488nm激光通常≥20,000小時)。
接近壽命終點時，提前聯(lián)系徠卡更換激光管。
3. 定期校準
光路校準：
每季度使用標準熒光微球(如TetraSpeck)校準光軸和針孔對齊。
機械校準：
每年檢查載物臺XY/Z軸精度(誤差應<0.1μm)，必要時調(diào)整步進電機參數(shù)。
五、常見問題解決
圖像無信號
檢查激光是否開啟、PMT增益是否>0、濾光片是否匹配(如發(fā)射濾光片未阻擋信號)。
圖像模糊
確認物鏡浸油是否充足、針孔是否偏移、樣品是否平整(如活細胞突起導致離焦)。
激光功率不穩(wěn)定
清潔激光器出口窗口，檢查冷卻系統(tǒng)水溫是否在設定范圍(如±0.5℃)。
軟件卡頓
關閉其他大型程序，降低圖像分辨率或掃描速度，或增加計算機內(nèi)存(建議≥32GB)。
六、徠卡激光共聚焦顯微鏡安全注意事項
激光安全：
操作時佩戴激光防護眼鏡(波長需覆蓋所有使用激光線)。
禁止直視激光束或反射光，避免皮膚長時間暴露于高功率激光(如>50mW)。
生物安全：
處理活細胞或病原體時，在生物安全柜內(nèi)操作，防止樣本污染。
化學安全：
使用有機溶劑(如乙醇)清潔時，在通風櫥內(nèi)操作，避免吸入揮發(fā)氣體。
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